SDS主要用于分离具有完整或H、L链形式的ADC。与SEC不同，十二烷基硫酸钠也可用于分离sFC和Fd片段。
随着近年来ADC领域的快速发展，测量药物抗体比(DAR)的表征分析在ADC的发现、开发和制造中发挥重要作用。由于ADC的复杂性和异质性，传统的蛋白质分析方法不能直接应用于ADC的DAR测定。目前已经报告了适合于建立DAR表征的多种方法，但由于其结构的复杂性，挑战仍然存在。本文我们就DAR表征分析方法做一个简单介绍。
HIC-HPLC是一种成熟的技术，用于根据ADC的固有疏水性来分离ADC。目前，HIC被认为是研究半胱氨酸偶联的ADC药物分布、裸抗含量和平均DAR的标准方法，并且只需要很少的样品量。以DAR小于7-8的传统基于半胱氨酸的ADC通常产生主要的五个种类(DAR=0、DAR=2、DAR=4、DAR=6和DAR=8)和少量的奇数DAR物种。HIC柱可以根据每种DAR种类不同有效载荷数量的疏水性位移来分离混合物中的这些物种，生成的色谱图可以用于计算DAR(图1)。由于HIC可以在天然条件下分离DAR种类，因此它不仅用于DAR的分析测定，而且还用于纯化。结合位点特异性的偶联和通过HIC纯化可以制备位点特异性和均一的DAR ADC。
然而，HIC分离也有一些缺点。这项技术不能提供与MS分析的兼容性，因为HIC要求在流动相中有高初始浓度的低挥发性盐。HIC分离的另一个缺点是ADC种类的回收率较低。
RPLC最常被用于评估平均DAR。恒峰娱乐入口HIC和RPLC的主要区别是蛋白质在RPLC条件下变性。因此，半胱氨酸偶联的ADC不能被完整地洗脱，因为mAb的L和H链之间的链间二硫键被破坏。RPLC主要用于分离与H和L相关的还原ADC的DAR种类，也可用于天然ADC分离L、H、HH、HL和HHL片段（图2）。这些峰在RPLC条件下可以很好地分开，以允许计算平均DAR。在RPLC中，与固定相的相互作用主要是通过蛋白质的非极性氨基酸和固定的N-烷基配体之间的疏水作用来实现的。溶质按其分子疏水性递增的顺序洗脱。
RPLC方法的一个缺点是测量(柱温)所需的升高温度和使用胍和DTT联合使用的变性预处理都可能会降低ADC的种类。这种潜在的降解可能会导致通过RPLC计算的DAR低于HIC或其他分析的DAR。最近些年也报道了在没有任何样品预处理的情况下对完整的ADC进行RPLC分析。
另一种确定DAR的重要方法是LC-MS。高效液相色谱与MS系统的结合是完整和亚单位ADC分析的常用方法(图3)。该技术不仅可以提供有效载荷分布，恒峰娱乐入口还可以提供每个DAR种类的分子量。
利用LC-MS进行ADC分析需要进行预处理，最近的一些研究集中在优化LC-MS的预处理上。例如，N-糖苷酶F的脱糖作用通常用于消除峰出现的复杂性。使用还原剂DTT可以得到ADC的重链和轻链，还原后通常进行烷基化以防止二硫键的重新形成。
因此，LC-MS作为一种理想的DAR测量方法具有很大的潜力。然而，这种方法可能不适用于特别亲水性的有效载荷。
UV/Vis光谱是一种简单方便的方法来确定ADC中与抗体偶联的药物的平均数量。这种方法要求药物和抗体的UV/Vis光谱具有不同的Amax值。由单抗在Amax处的ADC吸光度和消光系数以及药物在Amax处的消光系数可以确定药物的平均DAR（图4）。目前，该技术已被广泛应用于多种ADC药物的检测，如DM1、Calicheamicin类似物和vc-MMAE。
Ellman法是一种硫醇滴定方法，通过用UV/Vis在412 nm处测量吸光度来计算抑制率。Ellman试剂与游离的巯基反应，生成最大吸收波长在412 nm的2-硝基-5-巯基苯甲酸。该方法可以应用于基于半胱氨酸的ADC，因为共轭后可以测量残留的硫醇基团，因此可以间接计算DAR。总之，UV/Vis光谱方法是相对简单的，它不需要建立高效液相或质谱仪条件和复杂的样品制备。
SDS主要用于分离具有完整或H、L链形式的ADC。与SEC不同，十二烷基硫酸钠也可用于分离sFC和Fd片段（图5）。当CE-SDS用于赖氨酸偶联的ADC时，由于二硫键的相互作用，它分离了负载的H或L链。但主峰为以H2L2为代表的完整抗体约占96%。相反，当分析半胱氨酸偶联的ADC时，完整的H2L2仅占8.1%。恒峰娱乐入口因此，CE-SDS不能用于表征铰链区半胱氨酸偶联的ADC的DAR。因此，通常CE-SDS主要用于测定ADC的批次一致性。
